Page 122 - Laški smilj

Katja Kramberger

bodo ostale v stacionarni fazi. Spojine, ki so topne v obeh fazah, bodo
potovale s srednjo hitrostjo. Mobilna faza je navadno inertni helij. Surovi
izvleček, ki vsebuje hlapne snovi, se najprej raztopi v metanolu, nato se
ga upari in injicira na začetek kromatografske kolone. Sledi potovanje po
koloni skupaj s plinasto mobilno fazo (Abubakar in Haque 2020; Ingle idr.
2017). Metoda je predvsem kvantitativna, saj lahko določimo celokupno
količino hlapnih spojin (Sahira Banu in Cathrine 2015). Za določanje ses-
tave eteričnih olj in hidrolatov je detektor navadno masni spektrometer
(MS) ali plamensko ionizirajoči detektor (angl. flame ionization detector
– FID) (Almeida idr. 2024).
HPLC je učinkovita metoda za ločbo spojin in temelji na mehanizmu
adsorpcije. Ločimo lahko tako organske kot anorganske spojine. Sta-
cionarna faza je sestavljena iz trdnih delcev, tesno stisnjenih v kolono.
Stacionarna faza je navadno nepolarni C18, mobilna faza pa je polarna
– mešanica vode in še nekega drugega topila, ki dobro raztaplja analite
v vzorcu. Za elucijo analitov so potrebni visoki pritiski do 400 bar. Apa-
ratura je sestavljena iz vsebnika za mobilno fazo, injektorja, črpalke in
detektorja. Vzorec injiciramo in ga s pomočjo črpalke skupaj z mobilno
fazo vodimo čez kolono, kjer poteka ločba spojin (Abubakar in Haque
2020; Ingle idr. 2017). Na koncu detektor zazna spojine in pošlje signal do
računalnika. Osnovni detektor je navadno detektor UV-VIS, ki omogoča
merjenje absorpcijskega spektra naenkrat samo pri eni valovni dolžini,
ali detektor z nizom diod (angl. diode array detector – DAD), ki istočasno
posname spektre v celotnem območju UV-VIS. Če želimo spojine iden-
tificirati natančneje, za detekcijo izberemo masni detektor. Z metodo
HPLC lahko ločimo in detektiramo nehlapne spojine oz. spojine, ki so
občutljive na toploto. Metoda je lahko tako kvantitativna kot kvalitativna
(Abubakar in Haque 2020; Sahira Banu in Cathrine 2015).

Identifikacija bioaktivnih spojin
Identiteto spojin lahko določimo s kromatografskimi metodami, sklop-
ljenimi z masno spektrometrijo (npr. HPLC-MS, GC-MS), medtem ko
je za določitev točne kemijske strukture novih spojin potrebna uporaba
spektroskopskih metod, kot sta jedrna magnetna resonanca (angl. nu-
clear magnetic resonance – NMR) in infrardeča (angl. infrared – IR) spe-
ktroskopija. Osnovno načelo spektroskopskih metod je prehod elektro-
magnetnega sevanja skozi organsko molekulo, ki absorbira del prejetega
sevanja. Z merjenjem količine absorbiranega sevanja se lahko ustvari
spekter, ki je specifičen za določene vezi v molekuli. Na podlagi posnetega
122